Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi kancelaria@minrol.gov.pl
ul. Wspólna 30, 00-930 Warszawa www.gov.pl/rolnictwo
+48 22 250 01 18
Warszawa, 26 lutego 2024 r.
znak sprawy: DHR.bz.058.1.2024
Pan
Szymon Hołownia
Marszałek Sejmu RP
Dotyczy: odpowiedź na interpelację nr 1240 Posłów Jarosława Sachajko, Anny
Gembickiej, Marka Jakubiaka w sprawie propozycji Komisji Europejskiej z 5 lipca
2023 r. dotyczącej nowych technik genomowych
Szanowny Panie Marszałku,
przedkładam wyjaśnienia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi odnośnie interpelacji
nr 1240 dotyczącej nowych technik genomowych.
Proszę przyjąć poniższe wyjaśnienia zarówno jako odniesienie się do treści wstępnej
interpelacji jak również uzupełniających ją siedmiu pytań.
Przede wszystkim zgadzam się z wyrażonymi przez Państwa Posłów wątpliwościami
i uwagami do projektu rozporządzenia Komisji Europejskiej z dnia 5 lipca 2023 r.
w sprawie nowych technik genomowych. Pozwolę sobie zatem przedstawić
stanowisko rządu do tego projektu oraz informacje o zmianach, jakie nastąpiły
w trakcie ostatniego półrocza praz nad projektem.
Projekt rozporządzenia w sprawie roślin uzyskiwanych za pomocą niektórych nowych
technik genomowych oraz pochodzących z tych roślin żywności i pasz oraz w sprawie
zmiany rozporządzenia (UE) 2017/625 (dalej rozporządzenie NGT) został
opublikowany przez Komisję Europejską w dniu 5 lipca 2023 r. Od tego momentu
rozpoczęła się nad nim praca równolegle w Radzie i Parlamencie Europejskim.

-- 1 of 6 --

2
Polski rząd podzielił te same obawy, jakie wskazują Państwo Posłowie oraz
przywołane przez Państwa organizacje obywatelskie czy też środowiska rolnicze.
W dniu 12 października 2023 r rząd RP przyjął negatywne stanowisko (załącznik 1. do
odpowiedzi). To stanowisko jest wciąż aktualne, ponieważ praca nad projektem nie
została zakończona, a w projekcie wciąż utrzymują się niejasności. W stanowisku rządu
wskazane zostały te same kwestie, które poruszone są w interpelacji Państwa Posłów,
czyli:
 zasady kontroli produktów NGT kategorii 1 w kontekście czystości produkcji
nasiennej, ekologicznej oraz zachowaniem prawa wyboru przez konsumentów,
 skutki patentowania roślin NGT i zaburzenie uczciwej konkurencji między
małymi i średnimi firmami hodowlano-nasiennymi, a globalnymi koncernami,
 zakres upoważnień dla Komisji Europejskiej w kwestii przygotowania aktów
wykonawczych,
 odebranie państwom członkowskim możliwości zakazania uprawy roślin NGT.
Od lipca 2023 r. prace nad projektem rozpoczęły grupa robocza Rady oraz dwie
komisje Parlamentu Europejskiego (AGRI oraz wiodąca ENVI). Do projektu Komisji
Europejskiej zaproponowano liczne poprawki, które w pewnej części konsumują
Państwa pytania.
Jedną z poprawek wprowadzonych na poziomie Rady, jest ważna dla Polski sprawa
czyli możliwość zakazu uprawy roślin NGT na terenie danego kraju (tzw. klauzula opt-
out). Klauzula ta będzie mieć zastosowanie tylko dla roślin NGT 2 (czyli kategorii
zbliżonej do GMO). Wraz z tą poprawką zniesiono obowiązek ustanawiania przez
państwa członkowskie zasad koegzystencji upraw NGT 2 z uprawami tradycyjnymi
i ekologicznymi. Projektowane przepisy w tym zakresie zostały dostosowane do
przepisów jakie obowiązują dla GMO (państwo członkowskie może wprowadzić
zasady koegzystencji i może wyłączyć teren swojego kraju spod upraw roślin NGT 2).
W zakresie Państwa pytania dotyczącego uzasadnienia naukowego dla wyboru
kryteriów ekwiwalentności z roślinami konwencjonalnymi (Aneks I do rozporządzenia)
informuję, że wiele Państw zgłaszało potrzebę przestawienia naukowych podstaw dla
dokonania przez Komisję Europejską takiego, a nie innego wyboru kryteriów. Po
wielokrotnych interwencjach grupy roboczej Rady, Komisja udostępniła dokument

-- 2 of 6 --

3
techniczny pod nazwą „Rationale for the equiwalence criteria in Anex I to the proposal
for a Regulation on plants obtained by certain newgenomic techniques” (załącznik nr
2 do odpowiedzi).
W dokumencie tym Komisja wyjaśniła, że kryteria zastosowane w Aneksie I zostały
opracowane w celu określenia rodzaju i liczby mutacji wprowadzonych w wyniku
zastosowanych technik czyli ukierunkowanej mutagenezy i cisgenezy, które można
również uzyskać konwencjonalnymi metodami hodowlanymi, lub które mogą wystąpić
spontanicznie. Kryteria wybrano po przeanalizowaniu 90 prac naukowych,
recenzowanych, oryginalnych badań i przeglądów dotyczących roślin uzyskanych za
pomocą konwencjonalnych metod hodowlanych oraz zmian genetycznych w roślinach
(wykaz literatury został dołączony do omawianego dokumentu). Celem analizy było
zbadanie:
 jakiego typu mutacje występują w wyniku naturalnej mutacji lub zastosowania
konwencjonalnych metod hodowli,
 jaki jest zakres wielkości tych mutacji,
 ile takich mutacji występuje zazwyczaj w jednej roślinie.
Zdaniem Komisji Europejskiej, bazując na publikacjach naukowych można stwierdzić,
że podobne rozmiarowo zmiany genomu obserwuje się w efekcie konwencjonalnych
prac hodowlanych na skutek naturalnych mutacji. Zgodnie z opinią Europejskiego
Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA ang. European Food Safety Authority)
przy tak niewielkiej liczbie zmian w sekwencji genomu nie występuje ryzyko efektów
ubocznych. Bazując na wskazanych publikacjach wybrano 5 kryteriów, które zostały
wpisane do Aneksu I. Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi przekazało dokument do
Ministerstwa Klimatu i Środowiska celem zaopiniowania i MKiŚ nie zgłosiło do niego
zastrzeżeń.
Zgodnie z projektem rozporządzenia NGT, procedura weryfikacji statusu roślin NGT
kategorii będzie opierać się właśnie o kryteria ujęte w Aneksie I. W przypadku oceny
wniosków złożonych zgodnie z tym rozporządzeniem, ocena statusu roślin NGT będzie
prowadzona przez organ państwa członkowskiego wyznaczony zgodnie z art. 4 ust. 4
dyrektywy 2001/18/WE (w przypadku Polski będzie to Minister Klimatu i
Środowiska). Ocena będzie dokonywana przez ekspertów zasiadających w Komisji ds.
GMM i GMO lub wyznaczanych przez członków tej Komisji do recenzji konkretnego
wniosku.

-- 3 of 6 --

4
Odnosząc się do wątku dotyczącego przekazania Komisji Europejskiej uprawnień do
przyjęcia aktów o charakterze nieustawodawczym o zasięgu ogólnym, które
uzupełniają lub zmieniają niektóre, inne niż istotne, elementy aktu ustawodawczego
chcę poinformować, że Polska wraz z grupą innych krajów stanowczo domagała się,
aby Prezydencja hiszpańska wystąpiła do Służb Prawnych Rady o pisemne stanowisko,
czy jest to poprawne prawnie.
Niestety pomimo wielokrotnie powtarzanej prośby Prezydencja hiszpańska nie uznała
za konieczne uzyskanie pisemnego stanowiska służb prawnych Rady. Zarówno
w ocenie Komisji Europejskiej jak i ówczesnej Prezydencji hiszpańskiej, dokonywanie
zmian w Aneksie I ma charakter techniczny i może nastąpić na drodze aktu
delegowanego. Zarówno Komisja Europejska jak też grupa państw, które bardzo
popierają ten projekt uważają, że taka konstrukcja pozwoli na elastyczność i szybką
reakcję w razie potrzeby zmiany kryteriów w Aneksie I –np. na skutek nowych odkryć
naukowych.
W naszej opinii zmiana Aneksu I jest zmianą istotną dla tego aktu prawnego, ponieważ
spełnienie kryteriów wymienionych w Aneksie I oznacza przyznanie kategorii NGT 1
i umożliwienie dostępu do rynku.
Pomimo niewystąpienia o opinię służb prawnych Rady Prezydencja hiszpańska
dostrzegła, że problem ten zgłasza wiele państw i zaproponowała poprawki do
procesu wydawania tego aktu delegowanego. Zgodnie z nimi Komisja Europejska musi
opublikować sprawozdanie zawierające dowody naukowe z uzasadnieniem, dlaczego
konieczne jest dokonanie zmian w Aneksie I. Jednocześnie w stosownych przypadkach
Komisja powinna uwzględnić opinię EFSA.
Kolejną ważną kwestią poruszoną w interpelacji, ale również w uwagach Polski i innych
krajów, jest zapewnienia identyfikowalności produktów NGT, a wraz z tym prawa
konsumentów do informacji oraz zapewnienia czystości produkcji ekologicznej.
Zgodnie z projektem rozporządzenia produkty NGT 2 mają być oznakowane zgodnie
z zasadami jakie obowiązują dla GMO – a więc będą one możliwe do zidentyfikowania.
Jednak w odniesieniu do kategorii NGT 1 rozporządzenie przewiduje jedynie
znakowanie materiału rozmnożeniowego zaś produkty pochodne NGT (żywność czy
pasza) mają pozostać nieoznakowane. Takie podejście uniemożliwia zachowanie

-- 4 of 6 --

5
czystości produkcji ekologicznej, w której zakazane jest stosowanie NGT i odbiera
konsumentom prawo wyboru produktu.
Jak już wspomniano w projekcie rozporządzenia jest wiele kwestii, które wymagają
uregulowania lub dookreślenia. Najwięcej obaw dostarcza kwestia patentowania roślin
NGT, na którą Państwo Posłowie również zwrócili uwagę.
Obawy o narażenie rolników i hodowców na ryzyko działań prawnych z tytułu
naruszenia patentów ale również kwestia dostępu do materiałów hodowlanych – to
obawy, które od samego początku prac nad tym rozporządzeniem wyrażała Polska
i wiele państw członkowskich. Takie obawy wyrażają również państwa, które
w pozostałym zakresie popierają projekt i dążą do jego szybkiego przyjęcia.
Zarówno Prezydencja hiszpańska jaki i obecnie belgijska starały się wprowadzić do
projektu zapisy, które miały uspokoić obawy dotyczące patentów. Zaproponowano
artykuł nakładający na Komisję Europejską obowiązek przygotowania raportu
o wpływie patentowania NGT na małe i średnie przedsiębiorstwa lub powołanie grupy
obserwatorów śledzących ten wpływ. Propozycje te Polska uznała za
niewystarczające.
Dużo bardziej zdecydowane kroki w tym kierunku podjął Parlament Europejski, który
również dostrzegł, że otwarcie rynku UE dla opatentowanych roślin NGT może mieć
wpływ na europejską hodowlę i zwiększyć dominację dużych firm na rynku nasiennym.
W swoich poprawkach Parlament Europejski zaproponował następującą zmianę:
„Wprowadza się całkowity zakazu patentowania wszystkich roślin NGT, materiału
roślinnego, ich części, informacji genetycznej i cech, które zawierają, aby uniknąć
niepewności prawnej, zwiększonych kosztów oraz uzależnienia rolników
i hodowców.”. Jest to jasny sygnał, że Parlament Europejski dostrzega problem
i proponuje dość radykalny krok w celu jego rozwiązania. Nie jest do końca jasne, czy
wprowadzenie takiego zapisu w treści rozporządzenia NGT będzie wystarczającym
zabezpieczeniem, ponieważ w zakresie praw własności intelektualnej obowiązują
również przepisy dyrektywy biotechnologicznej i dokumenty o charakterze
międzynarodowym.

-- 5 of 6 --

6
Uważamy za konieczne zapewnienie dalszego swobodnego dostępu hodowców do
materiałów hodowlanych, a rolników do korzystania z ich prac zgodnie z zasadami
Konwencji UPOV i rozporządzenia Rady (WE) 2100/94. Kontynuowanie tych zasad
zapewni utrzymanie stabilnego rozwoju hodowli roślin oraz równy dostęp do
materiałów hodowlanych dla małych, średnich i dużych firm.
Z wyrazami szacunku
Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi
Michał Kołodziejczak
/podpisano elektronicznie/
Załączniki:
1. Stanowisko Rządu RP
2. Rationale for the equiwalence criteria in Anex I to the proposal for a Regulation
on plants obtained by certain newgenomic techniques - ST 14204/23 INIT z
dnia 16 października 2023 r. zawierający naukowe podstawy kryteriów
Do wiadomości:
Kancelaria Prezesa Rady Ministrów

-- 6 of 6 --

PROJEKT STANOWISKA RP
przygotowany w związku z art. 10 ust. 1 ustawy z dnia 8 października 2010 r.
o współpracy Rady Ministrów z Prezydentem Rzeczypospolitej Polskiej oraz Sejmem i Senatem
w sprawach związanych z członkostwem Rzeczypospolitej Polskiej w Unii Europejskiej
(Dz.U. Nr 2013, poz. 1395 ze zm.)
Dotyczy
Wniosek dotyczący rozporządzenia Parlamentu
Europejskiego i Rady w sprawie roślin uzyskiwanych
za pomocą niektórych nowych technik genomowych
oraz pochodzących z tych roślin żywności i pasz,
oraz w sprawie zmiany rozporządzenia (UE) 2017/625
Data przekazania
dokumentu Polsce
przez SG Rady UE
10 września 2023 r.
Sygnatura dokumentu Komisja Europejska COM(2023) 411
Numer międzyinstytucjonalny 2023/0226(COD)
Procedura decyzyjna Zwykła procedura ustawodawcza
Tryb głosowania
w Radzie UE Większość kwalifikowana
Instytucja wiodąca Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi
Instytucje
współpracujące
Ministerstwo Klimatu i Środowiska
Ministerstwo Zdrowia
Główny Inspektorat Sanitarny
Data przyjęcia przez KSE 12 października 2023 r.

-- 1 of 8 --

Cel projektu aktu prawnego
Przedstawiony przez Komisję Europejską projekt rozporządzenia zawiera przepisy dotyczące
roślin otrzymywanych za pomocą nowych technik genomowych, czyli najnowszych metod
biotechnologicznych, które rozwinęły się w ciągu minionych dwudziestu lat, już po
wprowadzeniu w Unii Europejskiej przepisów regulujących kwestie GMO.
Punktem wyznaczającym początek pracy nad tym projektem była decyzja Rady 2019/1904
z dnia 8 listopada 2019 r.1, w której Rada zwróciła się do Komisji o przedłożenie analizy
w świetle wyroku Trybunału Sprawiedliwości Unii Europejskiej w sprawie C-528/162,
w którym zostało orzeczone, że jedna z technik genomowych (mutageneza ukierunkowana)
prowadzi do uzyskania modyfikacji genetycznych.
W przeprowadzonej na tej podstawie analizie3 Komisja dostrzegła, że przepisy Unii
dotyczące GMO (Dyrektywa 2001/18/WE4, rozporządzenie 1829/2003/WE5, rozporządzenie
1830/2003/WE6, Dyrektywa 2009/41/WE7) nie są odpowiednie, aby za ich pomocą
uregulować zasady zamierzonego uwalniania roślin NGT oraz wprowadzania do obrotu
produktów pochodzących z roślin NGT, w tym. żywności i pasz..
Efektem tej analizy było przygotowanie projektu nowego rozporządzenia w sprawie
zamierzonego uwalniania do środowiska roślin NGT i wprowadzania do obrotu żywności
i pasz pochodzących z roślin NGT.
Komisja Europejska wskazuje kilka powodów, które uzasadniają przygotowanie nowych
przepisów.
1 Decyzja Rady (UE) 2019/1904 z dnia 8 listopada 2019 r. wzywająca Komisję do przedłożenia analizy
w związku z wyrokiem Trybunału Sprawiedliwości w sprawie C-528/16 dotyczącej statusu nowych technik
genomowych na podstawie prawa Unii, i wniosku, o ile jest to stosowne w świetle wyników analizy.
2 Wyrok Trybunału Sprawiedliwości z dnia 25 lipca 2018 r., Confédération paysanne i in. przeciwko Premier
ministre i Ministre de l’agriculture, de l’agroalimentaire et de la forêt, C-528/16, ECLI:EU:C 2018, 583
3 Badanie statusu nowych technik genomowych na podstawie prawa Unii i w świetle wyroku Trybunału
Sprawiedliwości w sprawie C-528/16, SWD(2021) 92 final.
4 Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2001/18/WE z dnia 12 marca 2001 r. w sprawie zamierzonego
uwalniania do środowiska organizmów zmodyfikowanych genetycznie i uchylającej dyrektywę Rady
90/220/EWG (Dz. Urz. WE L 106 z 17.04.2001, str. 1, z późn. zm.; Dz. Urz. UE Polskie wydanie specjalne,
rozdz. 15, t. 6, str. 77).
5 Rozporządzenie (WE) nr 1829/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22 września 2003 r. w sprawie
genetycznie zmodyfikowanej żywności i paszy (Dz. Urz. UE L 268 z 18.10.2003, str. 1, z późn. zm.; Dz. Urz.
UE Polskie wydanie specjalne, rozdz. 13, t. 32, str. 432)
6 Rozporządzenie (WE) nr 1830/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22 września 2003 r. dotyczącego
możliwości śledzenia i etykietowania organizmów zmodyfikowanych genetycznie oraz możliwości śledzenia
żywności i produktów paszowych wyprodukowanych z organizmów zmodyfikowanych genetycznie i
zmieniającego dyrektywę 2001/18/WE (Dz. Urz. UE L 268 z 18.10.2003, str. 24, z późn. zm.; Dz. Urz. UE
Polskie wydanie specjalne, rozdz. 13, t. 32, str. 455)
7 Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2009/41/WE z dnia 6 maja 2009 r. w sprawie ograniczonego
stosowania mikroorganizmów zmodyfikowanych genetycznie (Dz. Urz. UE L 125 z 21.05.2009, str. 75)

-- 2 of 8 --

Po pierwsze, w preambule projektu Komisja wielokrotnie stwierdza, że rośliny NGT są
narzędziem, które przyczyni się do realizacji celów w zakresie innowacji i zrównoważonego
rozwoju Europejskiego Zielonego Ładu8 oraz Strategii "od pola do stołu"9 i Strategii
bioróżnorodności10 przy założeniu utrzymania wysokiego poziomu ochrony zdrowia ludzi
i zwierząt oraz środowiska - zgodnie z zasadą ostrożności.
Po drugie, rośliny NGT są uznane za rośliny zmodyfikowane genetycznie, lecz w odróżnieniu
od roślin GMO, nie zawierają fragmentów genów pochodzących z innych (odległych
taksonomicznie) gatunków jak GMO, dlatego wskazane było przygotowanie dla nich nieco
innego postępowania niż dla GMO.
Projekt dotyczy wyłącznie roślin otrzymanych za pomocą dwóch metod biotechnologicznych
– mutagenezy ukierunkowanej i cisgenezy lub pochodzących z połączenia tych procesów oraz
produktów, żywności i pasz zawierających te rośliny, składających się z tych roślin lub z nich
wyprodukowanych.
Kolejnymi powodami, dla których Komisja Europejska uznała, że zasady postępowania
z roślinami NGT powinny mieć własne regulacje, to podobieństwo niektórych roślin NGT do
roślin konwencjonalnych oraz trudność w przeprowadzaniu kontroli z powodu niedostępnych
metod wykrywania.
W niektórych przypadkach metody analityczne nie dają możliwości odróżnienia zmian w DNA
wprowadzonych za pomocą mutagenezy ukierunkowanej i cisgenezy od zmian, jakie nastąpiły w
DNA na skutek przypadkowych mutacji. Takie rozróżnienie jest możliwe tylko w przypadku
modyfikacji genetycznych wprowadzonych w wyniku transgenezy.
Przedmiotem tej regulacji są rośliny NGT i produkty wyprodukowane z roślin NGT w związku
z zamierzonym uwolnieniem do środowiska i wprowadzeniem do obrotu.
Projekt nie reguluje zamkniętego użycia NGT ani transgranicznego przemieszczania NGT.
Komisja Europejska proponuje podział roślin NGT na dwie kategorie.
• rośliny NGT kategorii 1 – które po ocenie przeprowadzonej przez krajowy organ
ds. GMO mogą być uznane za tożsame z roślinami konwencjonalnymi,
• rośliny NGT kategorii 2 – które będą podlegać podobnym wymogom jak te przewidziane
w przepisach UE dotyczących GMO.
Zgodnie z ustawą z dnia 4 września 1997 r. o działach administracji rządowej, organem
właściwym w sprawach GMO jest Minister Klimatu i Środowiska, a w sprawach genetycznie
zmodyfikowanej żywności i pasz odpowiednio – Minister Zdrowia, Główny Inspektor Sanitarny
8 Komunikat Komisji do Parlamentu Europejskiego, Rady, Europejskiego Komitetu Ekonomiczno-Społecznego
i Komitetu Regionów z dnia 11 grudnia 2019 r. pt. „Europejski Zielony Ład” COM(2019) 640 final
9 Komunikat Komisji do Parlamentu Europejskiego, Rady, Europejskiego Komitetu Ekonomiczno-Społecznego
i Komitetu Regionów z dnia 20 maja 2020 r. pt. „Strategia „od pola do stołu” na rzecz sprawiedliwego,
zdrowego i przyjaznego dla środowiska systemu żywnościowego” (COM(2020)0381).
10 Komunikat Komisji do Parlamentu Europejskiego, Rady, Europejskiego Komitetu Ekonomiczno-
Społecznego i Komitetu Regionów – Unijna strategia na rzecz bioróżnorodności 2030 – Przywracanie
przyrody do naszego życia (COM(2020) 380 final

-- 3 of 8 --

oraz Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi, co oznacza, że te organy będą odpowiedzialne za
ewentualne wdrażanie tego rozporządzenia w przyszłości.
Komisja proponuje aby w przypadku roślin NGT kategorii 1 – tylko materiał siewny takich
odmian będzie musiał zostać oznakowany. Na dalszych etapach produkcji nie będzie już
konieczności znakowania nasion przeznaczonych do dalszego przetwarzania, ani produktów, jakie
powstaną z takich nasion. Natomiast, w przypadku roślin NGT kategorii 2 – obowiązkowe jest
znakowanie materiału siewnego. Żywność i pasze wyprodukowane z NGT kategorii 2 będą
podlegały nadal identyfikowalności i etykietowaniu jako GMO, a dodatkowo mogą być
oznakowane z zaznaczeniem korzystnej cechy, którą posiadają jako NGT.
Państwa członkowskie nie będą miały prawa wprowadzić zakazu uprawy roślin NGT na swoim
terytorium. W tym miejscu zaznacza się istotna różnica w stosunku do roślin GMO, dla których
wprowadzenie takiego zakazu jest możliwe.
Bez względu na kategorię wszystkie rośliny NGT nie mogą być stosowane w rolnictwie
ekologicznym.
Obowiązkowe będą zasady koegzystencji dla upraw roślin NGT kategorii 2 – stąd rozporządzenie
wskazuje obowiązek dla państw członkowskich polegający na przygotowaniu przepisów
określających te zasady.
Do projektu rozporządzenia Komisja Europejska wyda 5 aktów wykonawczych, które mają
doregulować kwestie m.in. kryteriów nadania statusu rośliny NGT kategorii 1.
Stanowisko RP
Rząd ocenia negatywnie projekt rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie
roślin uzyskiwanych za pomocą niektórych nowych technik genomowych oraz pochodzących
z tych roślin żywności i pasz, oraz w sprawie zmiany rozporządzenia (UE) 2017/625.
W projekcie dokonano sztucznego podziału roślin NGT na dwie podgrupy (NGT kategorii 1
i NGT kategorii 2) i w zależności od klasyfikacji przewidziano różne ścieżki oceny
i postępowania - dla NGT kategorii 1 w sposób bardzo podobny jak dla roślin
konwencjonalnych, a dla NGT kategorii 2 jak dla GMO.
Rząd nie widzi uzasadnienia, aby dla roślin NGT kategorii 2 opracowywać kolejne przepisy
i tworzyć odrębne procedury, które będą się powielały z już istniejącymi od lat przepisami
i procedurami regulującymi kwestie GMO. Rośliny NGT kategorii 2 powinny być uznane
jednoznacznie jako rośliny GMO.
W tej sytuacji, z projektu rozporządzenia przedstawionego przez Komisję Europejską należy
wyłączyć wszystkie przepisy, które dotyczą roślin NGT kategorii 2, a dalszą dyskusję
prowadzić dla roślin NGT kategorii 1.
Rząd widzi potrzebę jednoznacznego rozstrzygnięcia jak należy traktować tę grupę roślin
NGT kategorii 1 - jak GMO czy jak rośliny konwencjonalne.
Brak pewności co do zasad klasyfikowania roślin NGT kategorii 1 oraz proponowane
w projekcie rozwiązania powodują niejasność i wątpliwości związane z:

-- 4 of 8 --

1) zasadami kontroli produktów NGT kategorii 1 w kontekście czystości produkcji
nasiennej, ekologicznej oraz zachowaniem prawa wyboru przez konsumentów;
2) przepisami dotyczącymi skutków patentowania roślin NGT kategorii 1 na podmioty
wytwarzające rośliny NGT kategorii 1 oraz na podmioty wytwarzające produkty
z tych roślin;
3) zaburzeniem uczciwej konkurencji między małymi i średnimi firmami hodowlano-
nasiennymi, a globalnymi koncernami.
Wątpliwość budzi też zakres upoważnień dla Komisji Europejskiej w kwestii przygotowania
aktów wykonawczych.
Uzasadnienie stanowiska RP
Niniejszy dokument jest podstawą rozpoczęcia na poziomie UE pracy legislacyjnej nad
nowymi przepisami, które mają uregulować zasady autoryzacji roślin otrzymywanych
z wykorzystaniem dwóch nowych technik genomowych – mutagenezy ukierunkowanej oraz
cisgenezy i kombinacji tych metod, oraz produktów, żywności i pasz zawierających te rośliny,
składających się z tych roślin lub z nich wyprodukowanych.
Projekt rozporządzenia stanowi wniosek ustawodawczy, który Komisja Europejska
skierowała do Parlamentu Europejskiego i Rady co oznacza, że nie należy go obecnie
traktować jako prawo ostateczne.
Po pierwszej ocenie dokumentów zaprezentowanych przez Komisję Europejską nasuwa się
szereg wątpliwości.
Konstrukcja projektu jest bardzo nieczytelna. Projekt opiera się na kaskadowych odwołaniach
do kilku innych aktów prawnych.
Projekt jest niespójny. Z jednej strony przepisy umożliwiają wprowadzenie na rynek jak
najwięcej roślin NGT z pożądanymi w rolnictwie cechami, z drugiej strony – dla części z nich
zakłada się taki sam reżim autoryzacji jak dla roślin GMO. Dla produktów NGT kategorii 2,
które będą miały status zbliżony do GMO, odmawia się państwom członkowskim zakazania
ich uprawy, natomiast nakłada się obowiązek określenia zasad koegzystencji w uprawie – ale
bez metod laboratoryjnego wykrywania.
Technologie NGT są rozwijane głównie poza UE. Na rynku światowym znajdują się nieliczne
produkty NGT, natomiast wiele produktów jest na etapie zaawansowanych prac badawczych
i przygotowania do wdrożenia. Zatem można przypuszczać, że głównym beneficjentem
nowych rozwiązań nie będą firmy europejskie.
Wątpliwości wyrażają również rolnicy zauważając że zostanie im ograniczone prawo do
swobodnego korzystania z nasion, a nowe techniki genomowe będą narzędziem w ręku
bardzo bogatych korporacji.
Obecnie nie ma metod analitycznych, dzięki którym można potwierdzić obecność NGT
w uprawie lub w produkcji.

-- 5 of 8 --

Przepisy projektu mogą nie zapewniać konsumentom możliwości wyboru pomiędzy
żywnością uzyskaną w sposób konwencjonalny a żywnością wyprodukowaną
z użyciem metod biotechnologicznych lub wzbudzać wśród nich wątpliwości co do
pochodzenia żywności - przykładowo tej wyprodukowanej z NGT 1, dla której obowiązek
znakowania dotyczy jedynie materiału siewnego lub tej wyprodukowanej z NGT 2, dla
których nie określono metod analitycznych.
Projekt rozporządzenia zakłada, że nie wszystkie NGT 2 będzie można wykryć metodami
analitycznymi. Jednocześnie przepisy zakładają, że NGT 2 podlegać będą tym samym
przepisom identyfikowalności i znakowania jak GMO. W związku z powyższym pojawiają
się wątpliwości i obawy jakie narzędzia będą dostępne organom urzędowej kontroli do
weryfikacji oznakowania żywności zawierającej, składającej się lub wyprodukowanej
z NGT 2.
Niepokojące jest również odebranie pańswom członkowskim możliwości zakazania uprawy
roślin NGT.
Projekt zawiera kilka przepisów dotyczących przygotowania aktów delegowanych
i wykonawczych, uprawniających Komisję do podejmowania decyzji w kluczowych
aspektach, m.in. takich jak informacje, które mają być dostarczone przez wnioskodawcę lub
kryteria określania równoważności dla NGT kategorii 1.
1. Ocena skutków prawnych – Rozporządzenie będzie powodować konieczność
nowelizacji przepisów krajowych. Nowelizacja obejmie następujące ustawy:
1) Ustawa z dnia 22 czerwca 2001 r. o mikroorganizmach i organizmach genetycznie
zmodyfikowanych11,
2) Ustawa z dnia 25 sierpnia 2006 r. o bezpieczeństwie żywności i żywienia12,
3) Ustawa z dnia 22 lipca 2006 r. o paszach13
W drodze nowelizacji muszą zostać wprowadzone przepisy wprowadzające
stosowanie tego rozporządzenia w tym rozszerzenie zakresów kompetencji
dotychczasowych organów właściwych ds. GMO, uporządkowanie przepisów
kontrolnych oraz przepisy upoważniające do wydania rozporządzeń wykonawczych
(np. w zakresie określenia zasad koegzystencji dla upraw roślin NGT kategorii 2).
2. Ocena skutków społecznych – Projekt został opublikowany przez Komisję
Europejską w dniu 10 lipca 2023 r., jego polska wersja językowa została
opublikowana dwa miesiące później – 11 września 2023 r. Minister Rolnictwa
i Rozwoju Wsi dwukrotnie umieścił informację o projekcie na stronie internetowej
MRiRW i zachęcił do wzięcia udziału w konsultacjach. W tej sprawie do Ministra
Rolnictwa i Rozwoju Wsi wpłynęły stanowiska od różnych organizacji
reprezentujących rolnictwo ekologiczne, rolników tradycyjnych, stowarzyszenia
11 Ustawa z dnia 22 czerwca 2001 r. o mikroorganizmach i organizmach genetycznie zmodyfikowanych (Dz.U. z
2022 r. poz. 546)
12 Ustawa z dnia 25 sierpnia 2006 r. o bezpieczeństwie żywności i żywienia (Dz.U. z 2023 r. poz. 1448)
13 Ustawa z dnia 22 lipca 2006 r. o paszach (Dz.U. z 2023 r. poz. 1149)

-- 6 of 8 --

konsumentów. Te podmioty oceniły projekt jednoznacznie negatywnie wskazując,
że jest to deregulacja dotychczasowych przepisów GMO, co będzie skutkować
negatywnym wpływem na tradycyjną i ekologiczną produkcję, może ograniczyć
dostęp do tradycyjnych nasion, odbierze prawo wyboru konsumentom.
Ostrożność wykazały środowiska naukowców i hodowców, którzy wskazują,
że projekt wymaga dalszej pracy. Projekt nie przyniósł oczekiwanych rozwiązań, nie
jest jasny w interpretacji i może powodować w przyszłości trudności z wdrażaniem.
Hodowcy odmian wskazują, że prace nad wykorzystaniem NGT mają w Polsce
charakter wyłącznie badawczy i prowadzone są na wąskiej grupie gatunków.
Należy zauważyć, że przepisy tego projektu nie dotyczą zamkniętego użycia NGT
w laboratoriach, zatem nie będą mieć wpływu na prowadzone w nich prace naukowe.
3. Ocena skutków gospodarczych – Projektowane rozporządzenie może mieć negatywny
wpływ na swobodę działalności gospodarczej w szczególności produkcję ekologiczną
i produkcję nasienną. Może zostać zakłócona produkcja ekologiczna oraz produkcja
„wolna od GMO”. Brak metod wykrywania modyfikacji w roślinach NGT oraz
obowiązek znakowania tylko materiału siewnego spowoduje, że do łańcuchów
żywnościowych w sposób niekontrolowany mogą się przedostać rośliny NGT.
4. Ocena skutków finansowych – Państwa członkowskie UE (w tym Polska) poniosą
koszty w związku z koniecznością dostosowania się do nowego rozporządzenia,
jednak na obecnym etapie trudno oszacować skutki finansowe dla budżetu państwa.
Szacunkowe środki finansowe pokrywane z budżetu ogólnego Unii Europejskiej
niezbędne do wdrożenia niniejszego wniosku w latach 2025-2027 wynoszą łącznie 2,4
mln EUR. Kwota ta będzie sfinansowana w ramach składki do budżetu ogólnego UE
przez wszystkie państwa członkowskie, zgodnie z ich procentowym udziałem w sumie
zasobów własnych UE. Oznacza to, że odpowiednia część polskiej składki,
wszacowanej wysokości ok. 4,9% kwoty przeznaczonej z budżetu UE na
przedmiotowy cel, tj. ok. 120 tys. EUR będzie przeznaczona na sfinansowanie ww.
wniosku.
W przypadku obciążeń finansowych związanych z wdrażaniem niniejszego
rozporządzenia, przewidywanych do sfinansowania z budżetu państwa, przedmiotowe
wydatki zostaną sfinansowane w ramach nakładów na te części budżetowe, z których
ponoszone będą wydatki przeznaczone na finansowanie działań wdrażających
niniejsze rozporządzenia – w tym z części 32 rolnictwo, części 46 ochrona zdrowia i
części 41 środowisko, bez konieczności ich dodatkowego zwiększania.
Informacja w sprawie zgodności projektu aktu z zasadą pomocniczości
Projekt rozporządzenia nie budzi zastrzeżeń w kontekście zgodności z zasadą
pomocniczości.

-- 7 of 8 --

Wykluczenie roślin NGT z obecnych unijnych ram prawnych i pozostawienie tej
sprawy państwom członkowskim doprowadziłoby prawdopodobnie do różnych
wymogów regulacyjnych i poziomów ochrony w Unii.
Przedstawiciel Rządu upoważniony do prezentowania stanowiska
Anna Gembicka
Sekretarz Stanu w Ministerstwie Rolnictwa i Rozwoju Wsi

-- 8 of 8 --

14204/23 VW/lg 1
LIFE.3 EN
Council of the
European Union
Brussels, 16 October 2023
(OR. en)
14204/23
AGRI 610
AGRILEG 235
ENV 1122
CODEC 1884
Interinstitutional File:
2023/0226(COD)
NOTE
From: General Secretariat of the Council
To: Delegations
Subject: Regulation on new genomic techniques (NGT) – Technical paper on the
rationale for the equivalence criteria in Annex I
Delegations will find in annex a technical paper prepared by the Commission services on the
rationale for the equivalence criteria in Annex I.

-- 1 of 16 --

14204/23 VW/lg 2
ANNEX LIFE.3 EN
ANNEX
Rationale for the equivalence criteria in Annex I to the proposal for a
Regulation on plants obtained by certain new genomic techniques
Technical paper by the Commission services
This technical paper provides detailed explanation on the rationale for the criteria in Annex I of the proposal
for a regulation on plants obtained by certain new genomic techniques (NGTs) and their food and feed (in
the following “the NGT proposal”)1, and presents information on the relevant scientific literature.
The criteria were developed to define type and number of mutations introduced by targeted mutagenesis and
cisgenesis that could also be obtained by conventional breeding methods or could occur spontaneously. They
were developed on the basis of a literature analysis of 90 scientific, peer-reviewed original studies and
reviews (see Annex) on plants obtained by conventional breeding methods2 and on genetic variations in
plants. The objective of the analysis was to explore:
• Which type of mutations occur due to natural mutation or application of conventional breeding
methods.
• What size ranges these mutations span.
1 COM(2023) 411 final
2 For a description of conventional breeding techniques in plants, see e.g.:
• EFSA Panel on Genetically Modified Organisms (GMO). (2012). Scientific opinion
addressing the safety assessment of plants developed using zinc finger nuclease 3 and other
site‐ directed nucleases with similar function. EFSA Journal, 10(10), 2943.
https://doi.org/10.2903/j.efsa.2012.2943
• European Commission, Directorate-General for Research and Innovation, New techniques
in agricultural biotechnology, Publications Office, 2017,
https://data.europa.eu/doi/10.2777/574498.

-- 2 of 16 --

14204/23 VW/lg 3
ANNEX LIFE.3 EN
• How many of these mutations do typically occur in a single plant.
Also relevant considerations in scientific opinions issued by the European Food Safety Authority (EFSA)3
and scientific work of the Joint Research Centre (JRC)4 were taken into account in defining the criteria.
Similar genetic modifications obtained by different techniques are not expected to present different risks.
Therefore, this analysis was not meant to assess the effects of genetic variations or genetic modifications
introduced by conventional breeding methods.
1. Nature of the criteria
The criteria are based on the modifications resulting from the technique(s), i.e., on molecular characteristics.
Furthermore, if certain type and number of mutations can be introduced by both conventional breeding
techniques and NGTs, also the type of traits associated to these mutations would not be different between the
techniques. Therefore, for the purpose of assessing equivalence, the analysis of type and number of
mutations is considered sufficient.
3 EFSA Panel on Genetically Modified Organisms, 2012. Scientific opinion addressing the safety
assessment of plants developed through cisgenesis and intragenesis. EFSA Journal
2012;10(2):2561.
EFSA Panel on Genetically Modified Organisms, ‘Applicability of the EFSA Opinion on SDNs
type 3 for the safety assessment of plants developed using SDNs type 1 and 2 and
oligonucleotide-directed mutagenesis’, EFSA Journal 2020;18(11):6299.
https://doi.org/10.2903/j.efsa.2020.6299
EFSA Panel on Genetically Modified Organisms, 2022. Updated scientific opinion on plants
developed through cisgenesis and intragenesis. EFSA Journal 20(10):7621, 33 pp.
https://doi.org/10.2903/j.efsa.2022.7621.
EFSA Panel on Genetically Modified Organisms, 2022. Statement on criteria for risk assessment of
plants produced by targeted mutagenesis, cisgenesis and intragenesis. EFSA Journal
20(10):7618, 12 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2022.7618
4 Broothaerts, W., Jacchia, S., Angers, A., Petrillo, M., Querci, M., Savini, C., Van den Eede, G.
and Emons, H., New Genomic Techniques: State-of-the-Art Review, EUR 30430 EN,
Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2021, ISBN 978-92-76-24696-1,
doi:10.2760/710056, JRC121847

-- 3 of 16 --

14204/23 VW/lg 4
ANNEX LIFE.3 EN
2. Justification of the type of genetic modifications included in the criteria
The literature analysis as described in the Annex showed that targeted mutagenesis and cisgenesis techniques
can lead to genetic modifications that are similar to mutations occurring spontaneously in nature or as a
result of conventional breeding techniques, including random mutagenesis techniques using chemicals or
various types of irradiation. These mutations include substitutions, insertions (including duplications,
translocations and inversions) and deletions of nucleotides in the DNA. Furthermore, insertions of cisgenes5
or parts of cisgenes are also possible through crossing or conventional breeding. These types of mutations are
observed also in combination.
In view of these results and EFSA’s conclusion that targeted mutagenesis and cisgenesis (with the exclusion
of intragenesis) do not per se generate specific hazards different to those from conventional breeding
methods, targeted substitutions, insertions and deletions (criteria 1 and 2 of Annex I of the NGT proposal),
targeted insertions and substitutions of cisgenes (criterion 3) as well as targeted inversions (criterion 4) were
included among the criteria of equivalence. Criterion 5 was included to consider possible outcomes (DNA
sequences) that might be shown to occur in a species from the breeders’ gene pool6 but that might not be
covered by the previous criteria. This criterion provides a derogation only from criterion 3 and from the
condition that the genetic modification does not interrupt an endogenous gene.
Based on EFSA’s conclusion that intragenic plants7 may entail additional hazards compared to
conventionally bred plants, intragenesis was excluded from the criteria by setting, under criterion 3, the two
conditions of (i) no interruption of an endogenous gene8 and (ii) insertion of (criterion 3a) or substitution
with (criterion 3b) a contiguous DNA sequence. The random insertion of a cisgene was also excluded to take
into account EFSA’s opinion that an interruption of an endogenous gene by a cisgene may give rise to
additional hazards that would require assessment. As regards criteria 1 and 2, they also only cover targeted
modifications, since random mutagenesis is already exempted from the application of the GMO legislation
and is not in the scope of the NGT proposal.
5 A gene originating from the same or a crossable species.
6 For the definition of breeders’ gene pool see COM(2023) 411 final, Article 3(6).
7 Plants containing a rearranged copy of genetic material originating from the same or a crossable
species.
8 An endogenous gene is a gene present in the target organism.

-- 4 of 16 --

14204/23 VW/lg 5
ANNEX LIFE.3 EN
3. Justification of the size limits of individual genetic modifications included in the
criteria
On the basis of the literature research, it appears that substitutions occurring after application of conventional
methods typically affect one or few adjacent nucleotides. Insertions resulting from these methods can span
up to several million nucleotides in cases of structural rearrangements like duplications or translocations of
sequences already present elsewhere in the genome. Insertions of more random sequences are typically of a
length of less than ten nucleotides but have been observed to extend to approximately fifty nucleotides.
Furthermore, although smaller insertions so far have been reported to occur more frequently than larger
rearrangements, the improvement of detection methods (i.e. long-read sequencing) has started to unveil
higher rates of large insertions than previously estimated. Deletions of less than fifty nucleotides seem to be
the most common, but deletions affecting large regions of plant genomes spanning up to several hundred or
thousand nucleotides have also been observed. Finally, as with other structural rearrangements, inversions of
several million nucleotides have been reported to occur after use of conventional methods.
Considering these findings in the literature, no thresholds for the lengths of admissible deletions and
inversions were set in criterion 2 and 4, respectively.
In contrast, a threshold of twenty nucleotides in criterion 1 for substitutions and insertions was set since it fits
with the sizes observed in the scientific analysis. The described very large insertions as part of structural
rearrangements should be considered insertions of a cisgene, which are covered by criterion 3. Insertions of
random sequences were reported to be much smaller. Furthermore, when considering genome diversity, the
JRC calculated that the theoretical probability that a random sequence is unique in the genome of various
crops boils down to a consistent relatively narrow size range between 19 and 21 bases4. This means that a
modified sequence smaller than this size may already occur elsewhere in the genome and may therefore be
already part of the natural genetic diversity.
As regards the threshold for the length of substitutions, the same threshold as for insertions of random
sequences has been applied since substitutions can be considered as a combination of deletion and insertion.
Any deviation between the threshold applicable to insertions and the one applicable to substitutions would
thus have created an inconsistency.

-- 5 of 16 --

14204/23 VW/lg 6
ANNEX LIFE.3 EN
4. Justification of the numerical limit of individual genetic modifications per plant
included in the criteria
As regards the total number of modifications in an individual plant introduced by conventional breeding
techniques, the literature illustrated variability depending on various factors, in particular the organism and
the method used. In general, higher doses of chemicals or radiation and longer exposure times increased the
number of genetic modifications in individual plants. Additionally, polyploid plants9 tended to exhibit
greater numbers of genetic modifications compared to monoploid plants. Typically, from the literature
analysis, the total number of genetic modifications in individual viable plants ranged from thirty to one
hundred. The mutation frequency after using random mutagenesis was higher compared to natural mutation
rates. It remained nevertheless below the total number of accumulated single nucleotide polymorphisms10
naturally occurring between different cultivars or the number of genetic mutations resulting from
conventional methods using tissue culture, clonal propagation or protoplast regeneration.
Through conventional breeding, new or improved cultivars are obtained by stacking genes or making new
genomic combinations. However, these techniques are more successful for some crops and genes than for
others. While in general stacking of multiple desirable modifications is possible with conventional methods,
there are several examples where conventional breeding is not effective in this respect, due to a number of
factors. The probability to achieve specific, potentially more extensive, combinations of modifications as a
result of the application of conventional methods may be low11. Based on this, a limit to the total number of
individual modifications per plant was set to twenty in Annex I of the NGT proposal. By this threshold, a
demarcation is drawn so to exclude from category 1 of the proposal NGT plants with complex modifications
unlikely to be obtainable by conventional breeding methods.
The increasing precision of certain NGTs compared to conventional breeding approaches is well recognised
in the scientific community12. However, to consider in the verification of equivalence all possible
modifications introduced by the use of the new techniques, the limit of 20 to the total number of individual
modifications per plant is set to cover not only the on-target genetic modifications but also possible off-target
modifications occurring in DNA sequences sharing sequence similarity with the targeted site that can be
predicted by bioinformatic tools.
9 Plants containing more than two homologous chromosomes.
10 Substitutions at a single position in the genome.
11 For example, traditional mutagenesis and plant breeding have not been effective in obtaining low
gluten wheat varieties for patients with coeliac disease due to the significant number of
specific mutations required to obtain such a trait. Targeted mutagenesis has been instead
used to precisely and efficiently reduce the amount of gluten in wheat seed kernels
(Sanchez-Leon et al., 2018).
12 SWD(2023) 412 final, section 1.1 and Annex 6.

-- 6 of 16 --

14204/23 VW/lg 7
ANNEX LIFE.3 EN
Annex
Analysis of the scientific literature on mutations occurring naturally or obtained by
conventional breeding techniques
1. Introduction
The Commission’s services analysed scientific, peer-reviewed literature regarding the type, size and
occurrence of mutations, as well as the number of mutated genes, which mainly focuses on random
mutagenesis techniques such as irradiation and the application of EMS. The mutations induced by random
mutagenesis techniques (e.g. using ethyl methanesulfonate (EMS), gamma ray irradiation, fast-neutron (FN)
irradiation) include nucleotide substitutions, insertions and deletions of various sizes. Mutations
introduced by these techniques are comparable to mutations derived from certain NGTs in which breaks are
induced in the DNA and edits result from imperfections in the natural DNA repair mechanism of plants
(EFSA GMO Panel, 2012; Pacher and Puchta, 2017; Holme, Gregersen & Brinch-Pedersen, 2019; EFSA
GMO Panel, 2020). According to the consulted literature, random mutagenesis techniques lead to a lower
number of mutations compared to e.g. in vitro breeding techniques such as tissue culture and clonal
propagation (Zhang et al., 2014; Adamek et al., 2022). Also, the natural variation found in existing cultivars,
generated over time by natural and breeding processes, is much larger than the number of mutations induced
by random mutagenesis (Anderson et al., 2016).
The types of mutations described below have been observed in the literature analysis. Combination of these
types of mutations were also observed (Belfield et al., 2012; Hase et al., 2023; Li et al., 2016b; Weng et al.,
2019).
2. Type and size of mutations caused by random mutagenesis techniques
2.1. Substitutions
Single base substitutions (SBSs), i.e. the replacement of a single nucleotide or a few adjacent nucleotides in
the DNA, were the most common group of edits when using FN irradiation in rice (52.6% of observed
mutations) (Li et al., 2016a). The majority of mutations in carbon ion-irradiated Arabidopsis thaliana also
constituted SBSs (38%-43% in dry seed and 59%-62% in seedlings) (Hase et al., 2018). SBSs were also four
times more frequent compared to short insertions or deletions (indels) in six gamma-irradiated rice lines,
where they were randomly distributed over the genome (Li et al., 2016b). In addition, the application of
EMS for random mutagenesis in Arabidopsis, soybean and rice led predominantly to SBSs (e.g. more than
99% of mutations are G/C to A/T transitions in Arabidopsis) (Greene et al., 2003; Cooper et al., 2008; Henry
et al., 2014). These results indicate that SBSs are commonly observed as a result of random mutagenesis.

-- 7 of 16 --

14204/23 VW/lg 8
ANNEX LIFE.3 EN
2.2. Deletions
Although SBSs were the most abundant mutations overall in FN-irradiated rice, the largest fraction of
mutated genes (71.5%) harboured deletions. Of these, small deletions were the most abundant, with 26.3%
comprising a single base pair (bp). Nevertheless, several deletions exceeding a size of 1 kilobase pair (kbp)
were also observed and the largest deletions spanned several hundred kbp (Li et al., 2016a). The most
frequent mutation type in 24 rice plants with a mutant phenotype after gamma ray irradiation were small
deletions of up to 16 bp (62.5%), but larger deletions ranging in size between 9 and 130 kbp were also noted
(16.9%) (Morita et al., 2009). Large deletions were also observed in 264 FN-irradiated soybean lines, where
on average two to three homozygous deletions of more than 500 bp were detected per line (Bolon et al.,
2014). In five FN-irradiated common bean plants, large deletions were found to range in size from 40 bp to
43 kbp (O´Rourke et al., 2013). The majority of the deletions in carbon ion-irradiated dry seed and seedlings
of Arabidopsis were below 50 bp in size (95% in dry seed and 91.5% in seedlings), but larger deletions of
more than 1 kbp were also observed (Hase et al., 2018). A recent study of the same group comparing carbon
ion and gamma ray irradiation of dry seed and seedlings of Arabidopsis produced similar results with mainly
deletions of less than 10 bp but also several instances of large deletions of more than 100 bp particularly
when using carbon ion irradiation. The largest deletion found had a size of 380 kbp (Hase, Satoh &
Kitamura, 2023). Likewise, in FN-irradiated Arabidopsis most of the deletions (97%) were smaller than
56 bp in length, with single base deletions being the most frequently observed (36%). However, a larger
deletion of 7.2 kbp was also identified (Belfield et al., 2012). In a similar study, Li et al. (2001) found that in
FN-irradiated Arabidopsis lines most of the deletions were of a size of up to 4 kbp (58.3%). However,
deletions as large as 12 kbp were also found (Li et al., 2001). Large deletions of up to 35 kbp resulting from
FN irradiation of Arabidopsis were also reported in other studies (summarised in Li & Zhang, 2002).
In conclusion, although small deletions seem to be more abundant when using random mutagenesis
techniques, large deletions of several kbp also frequently occur.
2.3. Insertions
Although insertions are less frequently reported in comparison to deletions, they do occur. For instance, in
FN-irradiated rice most insertions identified were 1 bp long (69%). Insertions of 2-6 bp were also observed
(27%), while insertions of more than 10 bp were rare (Li et al., 2016a). In carbon ion-irradiated Arabidopsis,
single base insertions were most frequent (18 out of 35 insertion events), seven events were insertions of 2
bp and the remainder ranged between 3 and 47 bp (Hase et al., 2018). However, larger insertions of more
than 50 bp also occur, which are classified as several subtypes of Structural Variations (SVs), for instance
translocations, inversions and duplications (Saxena, Edwards & Varshney, 2014; Huang & Rieseberg, 2020;
Zanini et al., 2021). For instance, in 264 FN-irradiated soybean plants on average one segmental duplication
with an average size of more than 2 megabase pairs (Mbp) was identified per mutant line (Bolon et al.,
2014). Similarly, two studies using carbon ion or gamma ray irradiation on Arabidopsis revealed several
inversions and translocations of various sizes (Hase et al., 2018; Hase, Satoh & Kitamura, 2023).
Recent reports suggest that the prevalence of short-read sequencing techniques as the standard detection
method for genetic mutations may have led to an underrepresentation of the number and size of larger SVs in
the genomes of plants subjected to random mutagenesis techniques (Sedlazeck et al., 2018; De Coster & Van
Broeckhoven, 2019; Ho, Urban & Mills, 2020; Zanini et al., 2021; Lemay et al., 2022; Zhang et al., 2022).
Also, it was suggested that the combination of multiple algorithms for data analysis may improve the
detection rate of SVs (Hase, Satoh & Kitamura, 2023). Indeed, several recent studies reported a much higher
than predicted occurrence of SVs across conventionally bred and wild varieties of agricultural crops,
including maize, rice, grapevine, rapeseed and tomato (Chia et al., 2012; Wang et al., 2018; Zhou et al.,
2019; Fuentes et al., 2019; Alonge et al., 2020; Chawla et al., 2020; Huang & Rieseberg, 2020; Orantes-
Bonilla et al., 2022; Yildiz et al., 2023).

-- 8 of 16 --

14204/23 VW/lg 9
ANNEX LIFE.3 EN
In conclusion, although predominantly smaller insertions are detected after use of random mutagenesis
techniques, larger structural rearrangements involving insertions are also not uncommon.
3. Number of mutations introduced by random mutagenesis techniques
The number of mutations and mutated genes observed is dependent, amongst various factors, on the random
mutagenesis technique used. In FN-irradiated rice, the average number of mutated genes per line was 31
(varying between seven and 147) and the number of mutations per line was on average 59 (varying between
28 and 78) (Li et al., 2016a). In Arabidopsis, six FN-irradiated mutation lines were reported to display a
number of mutations ranging between eight and 32 per line (Belfield et al., 2012). Between 41 and 76
homozygous substitutions were found in 10 lines with a mutant phenotype in FN-irradiated soybean
(Anderson et al., 2016). As mentioned above, 1216 duplications and deletions were induced by FN
irradiation in a total of 264 soybean plants (averaging one segmental duplication, two to three homozygous
deletions and one hemizygous deletion per individual) (Bolon et al., 2014). In EMS-treated rice, per plant an
average of 37 mutations that were deleterious for the gene’s function was observed in a population of 72
individuals (the total number of mutations was more than 2700) (Henry et al., 2014). On average, higher
mutation densities are seen in polyploid species when using random mutagenesis techniques (Kurowska et
al., 2011).
4. Mutations as a result of other conventional breeding techniques
4.1. In vitro plant tissue/cell culture and clonal propagation
Genetic variation may result from stress factors during in vitro plant tissue culture, cell culture propagation
(somaclonal variation) or from clonal propagation. This variation can be the basis for the development of
new and improved cultivars, but it is not always desirable, e.g. in cases of in vitro cloning or germplasm
preservation (Krishna et al., 2016).
In in vitro propagated rice, somaclonal variation in the form of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
(substitutions) and indels was observed. The mutation rate of these regenerated rice lines was estimated at
1.74 x 10-6 base substitutions per site per generation (Miyao et al., 2012), which is higher than the estimated
natural mutation rate in rice of ~5.4 x 10-8 per site per diploid genome per generation (Tang et al., 2018).
Zhang et al. (2014) also identified extensive inheritable somaclonal genomic variation in rice tissue culture
and estimated a mutation rate of 5 x 10-5 base substitutions per site.
Non-heritable somatic mutations can accumulate in clonal propagation of micropropagated crops (e.g.
strawberry, banana, potato and coffee). More than 1 million Single Nucleotide Variants (SNVs, a single
nucleotide change in the DNA) were found in a clonally propagated cannabis line, with variation seen
between different tissues (Adamek et al., 2022). Larger structural genomic variations are also possible. For
example, all analysed potatoes within a set regenerated from protoplasts displayed aneuploidy or structural
chromosomal changes (Fossi et al., 2019). In addition, gene duplications and insertions of variable sizes can
occur through transposon activity (Cerbin & Jiang, 2018).
The above genetic changes are sometimes intentionally induced: the chemical mutagen colchicine is
commonly applied in conventional breeding for polyploidisation in vitro (Alemanno & Guiderdoni, 1994;
Eng & Ho, 2019). In addition, several commercial varieties belonging to various species have been derived
from somaclonal variation (Bhojwani & Dantu, 2013; Krishna et al., 2016).

-- 9 of 16 --

14204/23 VW/lg 10
ANNEX LIFE.3 EN
4.2. Natural mutation rate and inter-cultivar variation
Ossowski et al. (2010) observed a natural mutation rate of 7.1 x 10-9 per site per generation in A. thaliana. A
more recent study with this plant came to a similar conclusion with 6.95 x 10-9 single nucleotide mutations
per site per generation for lines that went through 25 generations. The rate of occurrence of indels was lower
at 1.30 x 10-9 per site per generation and deletions were more frequent and larger (excluding the seven
deletions greater than 100 bp, the mean was 6.5 bp) than insertions (mean 3.9 bp) (Weng et al., 2019). In
maize, the natural mutation rate was estimated at 2.17-3.87 x 10-8 per site per generation (Yang et al., 2017)
and in rice ~5.4 x 10-8 per site per diploid genome per generation (Tang et al., 2018). Analyses of SNPs and
indels showed that these were common in twelve analysed maize lines: SNPs and indels occurred on average
every 73 and 309 bp, respectively (Vroh Bi et al., 2005).
Genomic structural variation is also found in polyploid crops and can take the form of presence-absence
variation, copy-number variation and homoeologous exchanges (Schiessl et al., 2018). Although the natural
mutation rate is lower than the rate obtained through induced random mutagenesis, the amount of inter-
cultivar variation already available is extensive. Anderson et al. (2016) examined the genomic variation in
soybean cultivars and mutagenized plants. The inter-cultivar variation extending to over 1 million SNPs was
far greater than the variation seen amongst FN and Agrobacterium-transformed plants, which led to less than
100 single nucleotide substitutions genome-wide. Other examples include variation among elite maize inbred
lines (Lai et al., 2010), structural variation in rice (Fuentes et al., 2019) and variation in US wheat varieties
(Sthapit et al., 2022).
5. Gene introgression
Whole Genome Sequencing (WGS) can be used to identify the genetic diversity present in a species’ gene
pool which then can be utilized to introgress genetic regions of interest into elite cultivars by crop
improvement programs (Tao et al., 2019).
5.1. Resistance breeding
Resistance breeding is used for the development of new cultivars resistant to pathogens by introgressing
Resistance genes (R genes) from wild germplasm into agricultural varieties (Dangl et al., 2013). This is often
a time-consuming task, further complicated by the lack of knowledge on a large proportion of plant genetic
diversity that, to date, remains uncharacterized. Next-generation sequencing (NGS) and high-throughput
genotyping technologies (HTGT) can contribute to unveiling new R genes (Sánchez-Martín et al., 2019).
Introgressing R genes into elite cultivars can be time consuming for some crops such as those that are usually
vegetatively propagated (e.g. potato and banana) or trees (e.g. apple and citrus). In potato, it can take up to
50 years to introgress resistance into a new variety (Haverkort et al., 2009). Furthermore, to prevent
resistance breaking in the field, multiple R genes would need to be introgressed (Dangl et al., 2013). The
stacking of R genes through resistance breeding (“gene pyramiding”) has been demonstrated in sexually
propagated crops such as tomato, wheat, and pepper (Fuchs, 2017). For example, marker assisted breeding
was used to cross two grapevine cultivars carrying one R gene each to generate a new cultivar with two R
genes (Eibach et al., 2007). Similar successful attempts have been undertaken, inter alia, in rice for bacterial
leaf blight resistance (Suh et al., 2013), in maize for different virus resistances (Zambrano et al., 2014), in
barley for resistance against various pathogens (Friedt & Ordon 2007) and in wheat for powdery mildew
(Liu et al., 2008) and stem rust resistance (Liu et al., 2020).

-- 10 of 16 --

14204/23 VW/lg 11
ANNEX LIFE.3 EN
5.2. Examples of introgression of other traits
Hybridization and mutation breeding are two techniques that can be used for breeding soybean varieties with
high protein content (Guo et al., 2022). Several introgression lines carrying quantitative trait loci (QTLs) for
productivity, biotic and abiotic stress tolerance can be used for breeding programs (Ashikari & Matsuoka,
2006; Lippman et al., 2007). Abiotic tolerance traits have also been introgressed in commercial varieties, for
example in sunflower by hybridising two North American species (Whitney et al., 2010). Traits related to
drought tolerance have also been introgressed in cereal crops such as rice (Dharmappa et al., 2019), wheat
(Placido et al., 2013) and chickpea (Bharadwaj et al., 2021).
6. Modifications that are difficult to obtain by conventional breeding techniques
Through conventional breeding, new or improved cultivars are made by stacking genes or making new
genomic combinations (Prohens, 2011; Bradshaw, 2017). Random mutagenesis has further advanced
conventional breeding, by inducing mutations in agronomical interesting crops, which can be later crossbred
into elite cultivars. However, these techniques are more successful for some crops and genes than for others.
Several examples are given below where conventional breeding is slower and/or less efficient compared to
certain NGTs.
Gene stacking in vegetatively propagated crops is relatively difficult using conventional breeding techniques
despite advances such as speed breeding, genotyping, marker-assisted selection and high-throughput
phenotyping (Hickey et al., 2019; Hasan et al., 2021). Another factor making stacking of desirable traits less
efficient is the possibility of linkage drag: the association and carry-over of undesirable traits with desirable
ones (Wolter et al., 2019; Lee & Wang, 2020). Furthermore, the targeting of specific genes is not possible
when using conventional mutagenesis techniques. When using these techniques large progeny populations
and extensive screening are thus required. Nonaka et al. (2017) reported that, in an attempt to mutate the C-
terminus of GAD3 to increase the level of γ-aminobutyric acid (GABA) in tomato fruits, no such mutation
was found among ~4500 lines resulting from EMS mutagenesis. Likewise, the targeting of multiple
homologous genes or of genes responsible for polygenic traits, especially in polyploid species, can be
difficult using conventional breeding techniques (Liu et al., 2022; Martínez-Fortún et al. 2022). For example,
MLO is a well-known pathogen susceptibility gene that leads to enhanced resistance to powdery mildew
when knocked out (Jørgensen, 1992). Mlo mutants have since also been naturally found or induced through
random mutagenesis in crops such as cucumber, pea and tomato (Kusch & Panstruga 2017). CRISPR/Cas
was used to engineer the same trait in bread wheat, since no spontaneous or induced mlo mutants had been
reported, probably due to the presence of three different MLO homoeoalleles (Wang et al., 2014). Since then,
the same results were obtained by Targeting Induced Lesions IN Genomes (TILLING) and combining the
mutations by crosses (Acevedo-Garcia et al., 2017). Conventional breeding techniques can therefore be used
to obtain similar results as can be achieved by the application of certain NGTs. However, on average the
conventional breeding techniques are less efficient, require more resources and take longer than targeted
mutagenesis techniques. Even more so when a large number of genes need to be altered to achieve the
desired trait.
An example of multiple targeted gene knockouts is the low-gluten wheat that was obtained by CRISPR-Cas
editing of several homologs in the α-gliadin gene family (Sánchez-León et al., 2018). Low-gluten products
have been obtained through conventional breeding, such as low-gluten barley and wheat by combining
recessive alleles or deletion lines (Tanner et al., 2016; Van den Broeck et al., 2009). Compared to
conventional breeding however, the use of NGTs for multiplex targeted gene editing appears to be more
efficient and requires less back-crosses (Nogué et al., 2016).

-- 11 of 16 --

14204/23 VW/lg 12
ANNEX LIFE.3 EN
7. Conclusions
In this analysis, the most frequently reported mutations resulting from random mutagenesis techniques are
SBSs, followed by deletions and lastly insertions. Although the mutation frequency when using random
mutagenesis is higher compared to natural mutation rates, it is lower than the total accumulated number of
SNPs naturally occurring between different cultivars (Anderson et al., 2016) or the number of genetic
mutations resulting from tissue culture (Zhang et al., 2014), clonal propagation (Adamek et al., 2022) or
protoplast regeneration (Fossi et al., 2019).
Larger deletions, translocations, inversions and genome duplications also occur naturally; these mutations
depend on a variety of biological processes (e.g. homologous vs. non homologous DNA repair, or transposon
activity (Xiao et al., 2008; Anderson et al., 2019)). So far, they have been reported to occur less frequently
than smaller mutations, but the improvement of detection methods (i.e. long-read sequencing) has started to
unveil higher rates than previously estimated (Chia et al., 2012; Wang et al., 2018; Zhou et al., 2019;
Fuentes et al., 2019; Alonge et al., 2020; Chawla et al., 2020; Yildiz et al., 2023; Lemay et al., 2022; Zhang
et al., 2022). The occurrence of larger genome modifications can be enhanced using conventional breeding
techniques (Custers et al. 2019; Martínez-Fortún et al. 2022). Introgression of cisgenes is also possible and
broadly performed by conventional breeding methods. Finally, the average number of mutations per gene
and the number of mutated lines observed with conventional breeding methods is variable and dependent on
the technique and the reproductive capability of the plant material.
In certain cases, NGTs can produce genetic modifications that are difficult to obtain by conventional
breeding techniques: 1) “Gene pyramiding” is common for sexually propagated crops, but it is more
challenging for crops with a low regenerative potential or a long generation time (e.g. trees). Cisgenesis
using NGTs can greatly improve efficiency and reduce breeding time compared to conventional “gene
pyramiding”. 2) Targeting of multiple homologous genes is efficient using NGTs, but it is impractical or
extremely difficult using random mutagenesis, as it involves screening of large progeny populations.
References:
1. Acevedo-Garcia, J., Spencer, D., Thieron, H., Reinstädler, A., Hammond-Kosack, K., Phillips, A. L. & Panstruga, R.
(2017). Mlo-based powdery mildew resistance in hexaploidy bread wheat generated by a non-transgenic TILLING
approach. Plant biotechnology journal, 15(3), 367–378. https://doi.org/10.1111/pbi.12631
2. Adamek, K., Jones, A. M. P., & Torkamaneh, D. (2022). Accumulation of somatic mutations leads to genetic mosaicism in
cannabis. The plant genome, 15(1), e20169. https://doi.org/10.1002/tpg2.20169
3. Alemanno, L. & Guiderdoni, E. (1994). Increased doubled haploid plant regeneration from rice (Oryza sativa L.) anthers
cultured on colchicine-supplemented media. Plant cell reports, 13(8), 432–436. https://doi.org/10.1007/BF00231961
4. Alonge, M., Wang, X., Benoit, M., Soyk, S., Pereira, L., Zhang, L., … & Lippman, Z. B. (2020). Major impacts of
widespread structural variation on gene expression and crop improvement in tomato. Cell, 182(1), 145-161.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.021
5. Anderson, J. E., Michno, J. M., Kono, T. J., Stec, A. O., Campbell, B. W., Curtin, S. J., & Stupar, R. M. (2016). Genomic
variation and DNA repair associated with soybean transgenesis: a comparison to cultivars and mutagenized plants. BMC
biotechnology, 16(1), 41. https://doi.org/10.1186/s12896-016-0271-z
6. Anderson, S. N., Stitzer, M. C., Brohammer, A. B., Zhou, P., Noshay, J. M., O’Connor, C. H., … & Springer, N. M.
(2019). Transposable elements contribute to dynamic genome content in maize. The Plant journal: for cell and molecular
biology, 100(5), 1052–1065. https://doi.org/10.1111/tpj.14489
7. Ashikari, M. & Matsuoka, M. (2006). Identification, isolation and pyramiding of quantitative trait loci for rice
breeding. Trends in plant science, 11(7), 344–350. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2006.05.008
8. Belfield, E. J., Gan, X., Mithani, A., Brown, C., Jiang, C., Franklin, K., … & Harberd, N. P. (2012). Genome-wide analysis
of mutations in mutant lineages selected following fast-neutron irradiation mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Genome
research, 22(7), 1306–1315. https://doi.org/10.1101/gr.131474.111
9. Bharadwaj, C., Tripathi, S., Soren, K. R., Thudi, M., Singh, R. K., Sheoran, S., … & Varshney, R. K. (2021). Introgression
of “QTL‐ hotspot” region enhances drought tolerance and grain yield in three elite chickpea cultivars. The Plant
Genome, 14(1), e20076. https://doi.org/10.1002/tpg2.20076

-- 12 of 16 --

14204/23 VW/lg 13
ANNEX LIFE.3 EN
10. Bhojwani, S. & Dantu, P. (2013). Plant Tissue Culture: An Introductory Text. https://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9
11. Bolon, Y. T., Stec, A. O., Michno, J. M., Roessler, J., Bhaskar, P. B., Ries, L., … & Stupar, R. M. (2014). Genome
resilience and prevalence of segmental duplications following fast neutron irradiation of soybean. Genetics, 198(3), 967–
981. https://doi.org/10.1534/genetics.114.170340
12. Bradshaw, J. E. (2017). Plant breeding: past, present and future. Euphytica. 213, 60. https://doi.org/10.1007/s10681-016-
1815-y
13. Cerbin, S. & Jiang, N. (2018). Duplication of host genes by transposable elements. Current opinion in genetics &
development, 49, 63–69. https://doi.org/10.1016/j.gde.2018.03.005
14. Chia, JM., Song, C., Bradbury, P., Costich, D., de Leon, N., Doebley, J., … & Ware, D. (2012). Maize HapMap2 identifies
extant variation from a genome in flux. Nature Genetics 44, 803–807. https://doi.org/10.1038/ng.2313
15. Chawla, H. S., Lee, H., Gabur, I., Vollrath, P., Tamilselvan‐ Nattar‐ Amutha, S., Obermeier, C., ... & Snowdon, R. J.
(2021). Long‐ read sequencing reveals widespread intragenic structural variants in a recent allopolyploid crop plant. Plant
biotechnology journal, 19(2), 240-250. https://doi.org/10.1111/pbi.13456
16. Cooper, J. L., Till, B. J., Laport, R. G., Darlow, M. C., Kleffner, J. M., Jamai, A., … & Henikoff, S. (2008). TILLING to
detect induced mutations in soybean. BMC plant biology, 8, 9. https://doi.org/10.1186/1471-2229-8-9
17. Custers, R., Casacuberta, J. M., Eriksson, D., Sági, L. & Schiemann, J. (2019). Genetic alterations that do or do not occur
naturally; Consequences for genome edited organisms in the context of regulatory oversight. Frontiers in bioengineering
and biotechnology, 6, 213. https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00213
18. Dangl, J. L., Horvath, D. M. & Staskawicz, B. J. (2013). Pivoting the plant immune system from dissection to
deployment. Science, 341(6147), 746–751. https://doi.org/10.1126/science.1236011
19. De Coster, W. & Van Broeckhoven, C. (2019). Newest methods for detecting structural variations. Trends in
biotechnology, 37(9), 973-982. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2019.02.003
20. Dharmappa, P. M., Doddaraju, P., Malagondanahalli, M. V., Rangappa, R. B., Mallikarjuna, N. M., Rajendrareddy, S. H.,
… & Sheshshayee, S. M. (2019). Introgression of root and water use efficiency traits enhances water productivity: An
Evidence for physiological breeding in rice (Oryza sativa L.). Rice, 12(1), 14. https://doi.org/10.1186/s12284-019-0268-z
21. EFSA Panel on Genetically Modified Organisms (GMO). (2012). Scientific opinion addressing the safety assessment of
plants developed using zinc finger nuclease 3 and other site‐ directed nucleases with similar function. EFSA
Journal, 10(10), 2943. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2012.2943
22. EFSA Panel on Genetically Modified Organisms (EFSA GMO Panel), Naegeli, H., Bresson, J. L., Dalmay, T., Dewhurst, I.
C., Epstein, M. M., ... & Rostoks, N. (2020). Applicability of the EFSA Opinion on site‐ directed nucleases type 3 for the
safety assessment of plants developed using site‐ directed nucleases type 1 and 2 and oligonucleotide‐ directed
mutagenesis. EFSA Journal, 18(11), e06299. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2020.6299
23. Eibach, R., Zyprian, E., Welter, L. & Topfer, R. (2007). The use of molecular markers for pyramiding resistance genes in
grapevine breeding. Vitis 46(3), 120-124. https://doi.org/10.5073/vitis.2007.46.120-124
24. Eng, W.H. & Ho, W. (2019). Polyploidization using colchicine in horticultural plants: A review. Scientia Horticulturae.
246, 604-617. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2018.11.010
25. Fossi, M., Amundson, K., Kuppu, S., Britt, A. & Comai, L. (2019). Regeneration of Solanum tuberosum plants from
protoplasts induces widespread genome instability. Plant physiology, 180(1), 78–86. https://doi.org/10.1104/pp.18.00906
26. Friedt, W. & Ordon, F. (2007). Molecular Markers for Gene Pyramiding and Disease Resistance Breeding in Barley. In:
Varshney, R.K., Tuberosa, R. (eds) Genomics-Assisted Crop Improvement. Springer, Dordrecht.
https://doi.org/10.1007/978-1-4020-6297-1_4
27. Fuchs, M. (2017). Pyramiding resistance-conferring gene sequences in crops. Current opinion in virology, 26, 36–42.
https://doi.org/10.1016/j.coviro.2017.07.004
28. Fuentes, R. R., Chebotarov, D., Duitama, J., Smith, S., De la Hoz, J. F., Mohiyuddin, M., … & Alexandrov, N. (2019).
Structural variants in 3000 rice genomes. Genome research, 29(5), 870–880. https://doi.org/10.1101/gr.241240.118
29. Greene, E. A., Codomo, C. A., Taylor, N. E., Henikoff, J. G., Till, B. J., Reynolds, S. H., … & Henikoff, S. (2003).
Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics, 164(2),
731–740. https://doi.org/10.1093/genetics/164.2.731
30. Guo, B., Sun, L., Jiang, S., Ren, H., Sun, R., Wei, Z., … & Qiu, L. J. (2022). Soybean genetic resources contributing to
sustainable protein production. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik, 135(11), 4095–
4121. https://doi.org/10.1007/s00122-022-04222-9
31. Hasan, N., Choudhary, S., Naaz, N., Sharma, N., Laskar, R. A. (2021). Recent advancements in molecular marker-assisted
selection and applications in plant breeding programmes. Journal genetic engineering & biotechnology, 19, 128.
https://doi.org/10.1186/s43141-021-00231-1
32. Hase, Y., Satoh, K., Kitamura, S. & Oono, Y. (2018). Physiological status of plant tissue affects the frequency and types of
mutations induced by carbon-ion irradiation in Arabidopsis. Scientific reports, 8(1), 1394. https://doi.org/10.1038/s41598-
018-19278-1

-- 13 of 16 --

14204/23 VW/lg 14
ANNEX LIFE.3 EN
33. Hase, Y., Satoh, K. & Kitamura, S. (2023). Comparative analysis of seed and seedling irradiation with gamma rays and
carbon ions for mutation induction in Arabidopsis. Frontiers in plant science, 14, 1149083.
https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1149083
34. Haverkort, A. J., Struik, P. C., Visser, R. G. F. & Jacobsen, E. (2009). Applied biotechnology to combat late blight in
potato caused by Phytophthora Infestans. Potato research. 52, 249–264. https://doi.org/10.1007/s11540-009-9136-3
35. Henry, I. M., Nagalakshmi, U., Lieberman, M. C., Ngo, K. J., Krasileva, K. V., Vasquez-Gross, H., … & Comai, L. (2014).
Efficient genome-wide detection and cataloging of EMS-induced mutations using exome capture and Next-Generation
Sequencing. The Plant cell, 26(4), 1382–1397. https://doi.org/10.1105/tpc.113.121590
36. Hickey, L. T., N Hafeez, A., Robinson, H., Jackson, S. A., Leal-Bertioli, S. C. M., Tester, M., … & Wulff, B. B. H. (2019).
Breeding crops to feed 10 billion. Nature biotechnology, 37(7), 744–754. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0152-9
37. Ho, S.S., Urban, A.E. & Mills, R.E. (2020). Structural variation in the sequencing era. Nature reviews genetics, 21, 171–
189. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0180-9
38. Holme, I. B., Gregersen, P. L. & Brinch-Pedersen, H. (2019). Induced genetic variation in crop plants by random or
targeted mutagenesis: Convergence and differences. Frontiers in plant science, 10, 1468.
https://doi.org/10.3389/fpls.2019.01468
39. Huang, K. & Rieseberg, L. H. (2020). Frequency, origins, and evolutionary role of chromosomal inversions in
plants. Frontiers in plant science, 11, 296. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00296
40. Jørgensen, I. H. (1992). Discovery, characterization and exploitation of Mlo powdery mildew resistance in
barley. Euphytica 63, 141–152. https://doi.org/10.1007/BF00023919
41. Krishna, H., Alizadeh, M., Singh, D., Singh, U., Chauhan, N., Eftekhari, M. & Sadh, R. K. (2016). Somaclonal variations
and their applications in horticultural crops improvement. 3 Biotech, 6(1), 54. https://doi.org/10.1007/s13205-016-0389-7
42. Kurowska, M., Daszkowska-Golec, A., Gruszka, D., Marzec, M., Szurman, M., Szarejko, I. & Maluszynski, M. (2011).
TILLING: a shortcut in functional genomics. Journal of applied genetics, 52(4), 371–390. https://doi.org/10.1007/s13353-
011-0061-1
43. Kusch, S. & Panstruga, R. (2017). Mlo-based resistance: an apparently universal “weapon” to defeat powdery mildew
disease. Molecular plant-microbe interactions, 30(3), 179–189. https://doi.org/10.1094/MPMI-12-16-0255-CR
44. Lai, J., Li, R., Xu, X., Jin, W., Xu, M., Zhao, H., … & Wang, J. (2010). Genome-wide patterns of genetic variation among
elite maize inbred lines. Nature genetics, 42(11), 1027–1030. https://doi.org/10.1038/ng.684
45. Lee, K. & Wang, K. (2020). Level up to chromosome restructuring. Nature plants, 6(6), 600–601.
https://doi.org/10.1038/s41477-020-0669-4
46. Lemay, M. A., Sibbesen, J. A., Torkamaneh, D., Hamel, J., Levesque, R. C. & Belzile, F. (2022). Combined use of Oxford
Nanopore and Illumina sequencing yields insights into soybean structural variation biology. BMC biology, 20(1), 1-24.
https://doi.org/10.1186/s12915-022-01255-w
47. Li, X., Song, Y., Century, K., Straight, S., Ronald, P., Dong, X., Lassner, M. & Zhang, Y. (2001). A fast neutron deletion
mutagenesis-based reverse genetics system for plants. The plant journal: for cell and molecular biology, 27(3), 235–242.
https://doi.org/10.1046/j.1365-313x.2001.01084.x
48. Li, X. & Zhang, Y. (2002). Reverse genetics by fast neutron mutagenesis in higher plants. Functional & integrative
genomics, 2(6), 254–258. https://doi.org/10.1007/s10142-002-0076-0
49. Li, G., Chern, M., Jain, R., Martin, J. A., Schackwitz, W. S., Jiang, L., … & Ronald, P. C. (2016a). Genome-wide
sequencing of 41 rice (Oryza sativa L.) mutated lines reveals diverse mutations induced by fast-neutron
irradiation. Molecular plant, 9(7), 1078–1081. https://doi.org/10.1016/j.molp.2016.03.009
50. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y. & Huang, J. Z. (2016b). Frequency and type of inheritable mutations
induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University. Science. B, 17(12),
905–915. https://doi.org/10.1631/jzus.B1600125
51. Lippman, Z. B., Semel, Y. & Zamir, D. (2007). An integrated view of quantitative trait variation using tomato interspecific
introgression lines. Current opinion in genetics & development, 17(6), 545–552. https://doi.org/10.1016/j.gde.2007.07.007
52. Liu, J., Liu, D., Tao, W., Li, W., Wang, S., Chen, P., Cheng, S. & Gao, D. (2008), Molecular marker-facilitated pyramiding
of different genes for powdery mildew resistance in wheat. Plant Breeding, 119, 21-24. https://doi.org/10.1046/j.1439-
0523.2000.00431.x
53. Liu, T., Fedak, G., Zhang, L., Zhou, R., Chi, D., Fetch, T., … & Zhang, B. (2020). Molecular marker based design for
breeding wheat lines with multiple resistance and superior quality. Plant disease, 104(10), 2658–2664.
https://doi.org/10.1094/PDIS-02-20-0420-RE
54. Liu, X., Zhang, S., Jiang, Y., Yan, T., Fang, C., Hou, Q., … & Wan, X. (2022). Use of CRISPR/Cas9-based gene editing to
simultaneously mutate multiple homologous genes required for pollen development and male fertility in
maize. Cells, 11(3), 439. https://doi.org/10.3390/cells11030439

-- 14 of 16 --

14204/23 VW/lg 15
ANNEX LIFE.3 EN
55. Martínez-Fortún, J., Phillips, D. W. & Jones, H. D. (2022). Natural and artificial sources of genetic variation used in crop
breeding: A baseline comparator for genome editing. Frontiers in genome editing, 4, 937853.
https://doi.org/10.3389/fgeed.2022.937853
56. Miyao, A., Nakagome, M., Ohnuma, T., Yamagata, H., Kanamori, H., Katayose, Y., … & Hirochika, H. (2012). Molecular
spectrum of somaclonal variation in regenerated rice revealed by whole-genome sequencing. Plant & cell
physiology, 53(1), 256–264. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr172
57. Morita, R., Kusaba, M., Iida, S., Yamaguchi, H., Nishio, T. & Nishimura, M. (2009). Molecular characterization of
mutations induced by gamma irradiation in rice. Genes and Genetic Systems, 84(5), 361-370.
https://doi.org/10.1266/ggs.84.361
58. Nogué, F., Mara, K., Collonnier, C. & Casacuberta, J. M. (2016). Genome engineering and plant breeding: impact on trait
discovery and development. Plant cell reports, 35(7), 1475–1486. https://doi.org/10.1007/s00299-016-1993-z
59. Nonaka, S., Arai, C., Takayama, M., Matsukura, C. & Ezura, H. (2017). Efficient increase of ɣ-aminobutyric acid (GABA)
content in tomato fruits by targeted mutagenesis. Scientific reports, 7(1), 7057. https://doi.org/10.1038/s41598-017-06400-
y
60. O’Rourke, J. A., Iniguez, L. P., Bucciarelli, B., Roessler, J., Schmutz, J., McClean, P. E., … & Vance, C. P. (2013). A re-
sequencing based assessment of genomic heterogeneity and fast neutron-induced deletions in a common bean
cultivar. Frontiers in plant science, 4, 210. https://doi.org/10.3389/fpls.2013.00210
61. Orantes-Bonilla, M., Makhoul, M., Lee, H., Chawla, H. S., Vollrath, P., Langstroff, A., … & Snowdon, R. J. (2022).
Frequent spontaneous structural rearrangements promote rapid genome diversification in a Brassica napus F1
generation. Frontiers in plant science, 13. 1057953. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1057953
62. Ossowski, S., Schneeberger, K., Lucas-Lledó, J. I., Warthmann, N., Clark, R. M., Shaw, R. G., Weigel, D. & Lynch, M.
(2010). The rate and molecular spectrum of spontaneous mutations in Arabidopsis thaliana. Science, 327(5961), 92–94.
https://doi.org/10.1126/science.1180677
63. Pacher, M. & Puchta, H. (2017). From classical mutagenesis to nuclease-based breeding – directing natural DNA repair for
a natural end-product. The Plant journal: for cell and molecular biology, 90(4), 819–833. https://doi.org/10.1111/tpj.13469
64. Placido, D. F., Campbell, M. T., Folsom, J. J., Cui, X., Kruger, G. R., Baenziger, P. S. & Walia, H. (2013). Introgression of
novel traits from a wild wheat relative improves drought adaptation in wheat. Plant physiology, 161(4), 1806–1819.
https://doi.org/10.1104/pp.113.214262
65. Prohens J. (2011). Plant Breeding: A Success Story to be Continued Thanks to the Advances in Genomics. Frontiers in
plant science, 2, 51. https://doi.org/10.3389/fpls.2011.00051
66. Sánchez-León, S., Gil-Humanes, J., Ozuna, C. V., Giménez, M. J., Sousa, C., Voytas, D. F. & Barro, F. (2018). Low-
gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9. Plant biotechnology journal, 16(4), 902–910.
https://doi.org/10.1111/pbi.12837
67. Sánchez-Martín, J. & Keller, B. (2019). Contribution of recent technological advances to future resistance
breeding. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik, 132(3), 713–732.
https://doi.org/10.1007/s00122-019-03297-1
68. Saxena, R. K., Edwards, D. & Varshney, R. K. (2014). Structural variations in plant genomes. Briefings in functional
genomics, 13(4), 296-307. https://doi.org/10.1093/bfgp/elu016
69. Schiessl, S., Katche, E., Ihien, E., Chawla, H. S. & Harmeet, Mason, A. (2018). The role of genomic structural variation in
the genetic improvement of polyploid crops. The Crop Journal. 7(2), 127-140. https://doi.org/10.1016/j.cj.2018.07.006
70. Sedlazeck, F. J., Rescheneder, P., Smolka, M., Fang, H., Nattestad, M., Von Haeseler, A. & Schatz, M. C. (2018). Accurate
detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature methods, 15(6), 461-468.
https://doi.org/10.1038/s41592-018-0001-7
71. Sthapit, S. R., Ruff, T. M., Hooker, M. A. & See, D. R. (2022). Population structure and genetic diversity of U.S. wheat
varieties. The plant genome, 15(2), e20196. https://doi.org/10.1002/tpg2.20196
72. Suh, J. P., Jeung, J. U., Noh, T. H., Cho, Y. C., Park, S. H., Park, H. S., … & Jena, K. K. (2013). Development of breeding
lines with three pyramided resistance genes that confer broad-spectrum bacterial blight resistance and their molecular
analysis in rice. Rice, 6(1), 5. https://doi.org/10.1186/1939-8433-6-5
73. Tang, X., Liu, G., Zhou, J., Ren, Q., You, Q., Tian, L., … & Zhang, Y. (2018). A large-scale whole-genome sequencing
analysis reveals highly specific genome editing by both Cas9 and Cpf1 (Cas12a) nucleases in rice. Genome biology, 19(1),
84. https://doi.org/10.1186/s13059-018-1458-5
74. Tanner, G. J., Blundell, M. J., Colgrave, M. L. & Howitt, C. A. (2016). Creation of the first ultra-low gluten barley
(Hordeum vulgare L.) for coeliac and gluten-intolerant populations. Plant biotechnology journal, 14(4), 1139–1150.
https://doi.org/10.1111/pbi.12482
75. Tao, Y., Zhao, X., Mace, E., Henry, R. & Jordan, D. (2019). Exploring and Exploiting Pan-genomics for Crop
Improvement. Molecular plant, 12(2), 156–169. https://doi.org/10.1016/j.molp.2018.12.016

-- 15 of 16 --

14204/23 VW/lg 16
ANNEX LIFE.3 EN
76. Van den Broeck, H. C., van Herpen, T. W., Schuit, C., Salentijn, E. M., Dekking, L., Bosch, D., … & van der Meer, I. M.
(2009). Removing celiac disease-related gluten proteins from bread wheat while retaining technological properties: a study
with Chinese Spring deletion lines. BMC plant biology, 9, 41. https://doi.org/10.1186/1471-2229-9-41
77. Vroh Bi, I., McMullen, M. D., Sanchez‐ Villeda, H., Schroeder, S., Gardiner, J., Polacco, M. ... & Coe, E. H. (2006).
Single nucleotide polymorphisms and insertion–deletions for genetic markers and anchoring the maize fingerprint contig
physical map. Crop Science, 46(1), 12-21. https://doi.org/10.2135/cropsci2004.0706
78. Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, C. & Qiu, J. L. (2014). Simultaneous editing of three
homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature biotechnology, 32(9),
947–951. https://doi.org/10.1038/nbt.2969
79. Wang, W., Mauleon, R., Hu, Z., Chebotarov, D., Tai, S., Wu, Z., … & Leung, H. (2018). Genomic variation in 3,010
diverse accessions of Asian cultivated rice. Nature 557, 43–49. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0063-9
80. Weng, M. L., Becker, C., Hildebrandt, J., Neumann, M., Rutter, M. T., Shaw, R. G., Weigel, D. & Fenster, C. B.
(2019). Fine-grained analysis of spontaneous mutation spectrum and frequency in Arabidopsis thaliana. Genetics, 211(2),
703-714. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301721
81. Whitney, K. D., Randell, R. A. & Rieseberg, L. H. (2010). Adaptive introgression of abiotic tolerance traits in the
sunflower Helianthus annuus. The new phytologist, 187(1), 230–239. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2010.03234.x
82. Wolter, F., Schindele, P. & Puchta, H. (2019). Plant breeding at the speed of light: the power of CRISPR/Cas to generate
directed genetic diversity at multiple sites. BMC plant biology, 19(1), 176. https://doi.org/10.1186/s12870-019-1775-1
83. Xiao, H., Jiang, N., Schaffner, E., Stockinger, E. J. & Van Der Knaap, E. (2008). A retrotransposon-mediated gene
duplication underlies morphological variation of tomato fruit. Science, 319(5869), 1527-1530.
https://doi.org/10.1126/science.1153040
84. Yang, N., Xu, X. W., Wang, R. R., Peng, W. L., Cai, L., Song, J. M., … & Yan, J. (2017). Contributions of Zea mays
subspecies mexicana haplotypes to modern maize. Nature communications, 8(1), 1874. https://doi.org/10.1038/s41467-
017-02063-5
85. Yildiz, G., Zanini, S. F., Afsharyan, N. P., Obermeier, C., Snowdon, R. J. & Golicz, A. A. (2023). Benchmarking Oxford
Nanopore read alignment‐ based insertion and deletion detection in crop plant genomes. The Plant Genome, e20314.
https://doi.org/10.1002/tpg2.20314
86. Zambrano, J. L., Jones, M. W., Brenner, E., Francis, D. M., Tomas, A. & Redinbaugh, M. G. (2014). Genetic analysis of
resistance to six virus diseases in a multiple virus-resistant maize inbred line. Theoretical and applied genetics.
Theoretische und angewandte Genetik, 127(4), 867–880. https://doi.org/10.1007/s00122-014-2263-5
87. Zanini, S. F., Bayer, P. E., Wells, R., Snowdon, R. J., Batley, J., Varshney, R. K., ... & Golicz, A. A. (2022). Pangenomics
in crop improvement—From coding structural variations to finding regulatory variants with pangenome graphs. The Plant
Genome, 15(1), e20177. https://doi.org/10.1002/tpg2.20177
88. Zhang, D., Wang, Z., Wang, N., Gao, Y., Liu, Y., Wu, Y., … & Liu, B. (2014). Tissue culture-induced heritable genomic
variation in rice, and their phenotypic implications. PloS one, 9(5), e96879. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096879
89. Zhang, F., Xue, H., Dong, X., Li, M., Zheng, X., Li, Z., ... & Wei, C. (2022). Long-read sequencing of 111 rice genomes
reveals significantly larger pan-genomes. Genome Research, 32(5), 853-863. https://doi.org/10.1101/gr.276015.121
90. Zhou, Y., Minio, A., Massonnet, M., Solares, E., Lv, Y., Beridze, T., Cantu, D. & Gaut, B. S. (2019). The population
genetics of structural variants in grapevine domestication. Nature plants 5, 965–979. https://doi.org/10.1038/s41477-019-
0507-8

-- 16 of 16 --